免疫印迹膜（PVDF膜）的知识分享

一、免疫印迹膜的介绍

在Western blotting实验中，NC膜和PVDF膜是最chang用的两种膜。NC膜是特异性转移介质之一，使用范围十分广泛，也是最早用于Western blotting实验的膜。PVDF膜是在1985年开发出来的，它能在比较苛刻的条件下(比如在酸性或碱性条件下，或者在有机溶剂存在时)将蛋白保留，因此更广泛用于Western blotting实验中。

二、作用机理的介绍

1.  NC膜

NC膜与蛋白质之间是依靠静电作用和疏水作用相结合的，NC膜属于亲水膜，使用前无需进行预活化，使用方便、价格低廉、对蛋白质的活性影响小、背景低；但其韧性较差，易损坏，从而不能反复使用，如果在非离子型去污剂作用下，结合上的蛋白比较容易被洗脱下来。

2.  PVDF膜

PVDF膜与蛋白质之间是依靠疏水作用相结合的，与NC膜相比，PVDF膜有着ji好的化学稳定性和更高的机械强度，适合反复检测（reprobing）和多次剥离（stripping）。PVDF膜需要先用甲醇润湿后才能被常规的转膜液所浸润，转印缓冲液中添加的Ca2+离子能够增强钙调蛋白与Immobilon®-P转印膜的结合，钙的结合使蛋白质分子形成一个疏水袋结构，从而增加蛋白与膜的结合。此外，PVDF膜具有更高的蛋白结合能力，一般NC膜的结合能力是80-100μg/cm2，而PVDF膜可以达到150-160μg/cm2。因此，PVDF膜已成为现阶段实验室WB的常用膜。

三、PVDF膜使用须知

1. PVDF膜为什么需预先活化？

PVDF膜本质上是一种疏水性的聚合物，不带电荷并具有疏水性，不能被常规转膜液所浸润，为了在水性缓冲液中使用，需要在使用前进行预处理以浸润和活化膜。最chang用的方法是使用50%（v/v）或更高浓度的醇（甲醇、乙醇和异丙醇）溶液进行浸润和活化，使得PVDF膜中微孔内的空气能够被低表面张力的甲醇所替代，从而易于后续缓冲液进入PVDF膜中的微孔内，使得PVDF膜从疏水性转变为亲水性，在浸润过程中膜的外观会从不透明转变为半透明，此时表明PVDF膜已被wan全浸湿。然后用水反复冲洗以去除醇类，再直接将膜放入转印缓冲液中进行平衡。膜被浸湿后，通过电转移，蛋白质与膜接触发生疏水作用而被吸附在PVDF膜上。

2. PVDF膜孔径对蛋白结合的影响？

膜孔径越小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。首先，较小的孔径会限制蛋白分子的运动，减缓其转移速度，蛋白与膜的结合就更充分，从而更容易被拦截在孔道内；其次，较小的孔径还能提供较大的膜表面积，从而提高了蛋白与膜接触的机会；此外，较小的孔径也能提供更高的表面密度，从而增加了孔道与溶液间的分子间吸引力，这种吸附方式被称为“毛细作用"。Schweitzer和Kriz在一项研究中发现，较小的孔径可以增强其吸附能力并提供更高的蛋白密度，蛋白分子量越低，蛋白的比表面积越大，与膜接触面越大越充分，结合就更紧密。但是，如果膜的孔径小于0.1 μm，那么蛋白的转移就很难进行下去了，是因为蛋白质分子的直径大约在1-100 nm之间。

3. 如何选择PVDF膜？

一般情况下，分子量大于20kD的蛋白应选择0.45μm的膜，分子量小于20kD的蛋白应选择0.2μm的膜。0.2μm的PVDF膜内部表面积大约是0.45μm的PVDF膜的三倍，因此其吸附能力更高。总之，选择PVDF膜的孔径大小需要根据样品蛋白的特性和大小来确定，以期获得最佳的结合效果。

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