影响WB实验的因素有什么？

WB实验是分子生物学中最为常见的实验，那么你知道影响WB实验的因素有什么吗？让我们一起来看看吧！

一、蛋白样本制备

1. 蛋白质的样品制备注意以下问题：

（1）在合适的条件下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

（2）选择合适的表面活性剂和还原剂，使其形成各自多肽的溶液。

（3）尽量去除核酸，多糖，脂类等分子的干扰，裂解完毕离心之后取中层澄清溶液时避免吸到底层沉淀和上层脂类。

（4）整个制作蛋白样本的制备过程必须在低温下进行，避免细胞破碎释放出各种酶类，但是注意不要反复冻融。

（5）所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的pH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。

2. 小分子量蛋白10KD需要的注意点

（1）可选择孔径0.22μm的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系；

（2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移，其他按步骤即可。

3. 大分子量蛋白200KD需要的注意点：

（1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；

（2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）；

（3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高。

二、凝胶的配制

制胶关键是聚合时间，分离胶聚合控制在从加入10%AP和TEMED至开始凝胶，时间为10—20分钟(未wan全凝聚)，浓缩胶最佳聚合时间为8-10min，可通过控制AP和TEMED量来控制。

1. 凝胶质量

不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的pH值应在8.8左右，而浓缩胶的pH应在6.8左右，最好不要差过0.5个pH单位，因为这个pH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。

因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的pH值是否稳定是很重要的。

2. 在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象？

（1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行；

（2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的；

（3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象；

三、电泳

1. 应待凝胶充分凝固后电泳，或者催化剂加入后充分混匀，否则条带容易中间凹陷两边翘起。

2. 两板玻璃之间排除所有的气泡，防止条带中间鼓两边下陷。

3. 加样前离心，选择适当的样本缓冲液（尽量用新鲜配制的，这样能保证pH值和离子强度的稳定），加适量的样品促溶剂，防止wb条带拖尾或蛋白出现纹理。

4. 常用浓缩时80V，分离时100V比较好，条带很平。

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