你知道什么是Sanger双脱氧链终止法吗？

你知道什么是Sanger双脱氧链终止法吗？让我们一起来看看吧！

一、原理

Sanger双脱氧链终止法是第一代测序技术中最为经典的一种。其巧妙的利用DNA复制原理,利用ddNTP来部分代替常规的dNTP作为底物进行DNA合成反应。在DNA合成时,一旦ddNTP参入到合成DNA链中,由于ddNTP脱氧核糖的3’-位碳原子上缺少羟基，而不能与下一位核苷酸的5’-位磷酸基之间形成3’,5’-磷酸二酯键，从而使得正在延伸的DNA链在此ddNTP处终止。

二、实验步骤

1. 将待测序测序的DNA片段进行PCR扩增，得到充足的DNA模版用于进行测序。

得到的DNA模板需要进行纯化，需要确保去除所有杂质，包括DNA片段、蛋白质、RNA等。

2. 根据待测序列的特点与实验要求，设计一些特定的引物。

一般来说，通用引物的长度以15～30bp为宜。

3. 合成标记物。标记物是指示测序反应是否成功的物质，通常是一种荧光染料或放射性同位素。

4. 将DNA模板、引物、DNA聚合酶和标记物等物质混合在一起，进行测序反应。

在反应过程中，DNA聚合酶将根据DNA模板中的碱基序列合成新的DNA链，同时将标记物结合到新合成的DNA链中。

5. 将反应产物进行电泳分离，根据标记物的不同荧光信号或放射性同位素的存在，确定DNA序列中的碱基排列顺序。

在Sanger测序法的基础上，将荧光信号接收器和计算机信号分析系统替代放射自显影技术，使用荧光素标记替代32P或35S单一放射性核素标记，打开了DNA测序技术自动化的大门。

三、Sanger测序法的优缺点

优点：

1. Sanger是直接对DNA分子进行测序，适用于已知序列的验证测序、文库筛选、克隆鉴定、pcr重测序等。

2. 其zui大优点在于读取速度很高、高精确度，而且成本相对很低。相较于化学降解测序法，对于富含G-C的区域也不会影响测序效果。

缺点：

1. 必须有已经序列设计测序引物，对于未知序列必须构建克隆后才能测序，难以实现基因组水平的大规模测序。

2. 测定碱基序列需要大量wan全相同的DNA拷贝。

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