质粒构建的方法有哪些？

    细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。通过基因工程手段将需要的外源基因送进受体细胞中去进行增殖和表达。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞(如大肠杆菌)中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。那么你知道质粒构建的方法有哪些吗？让我们一起来看看吧！

一、酶切连接

传统意义上，质粒重组是基于碱基互补配对的原理，一般做法为：

1）通过引物在目的片段两端引入酶切位点；

2）用相同的限制性内切酶分别对目的片段和载体进行酶切处理；

3）目的片段和载体的酶切产物在体外连接；

4）连接产物转化大肠杆菌；

5）筛选重组子。

在实验中，我们的每一步都需要根据该目的基因与载体的特性调整实验；考虑到后续实验，在选择载体时务必要满足与宿主细胞兼容且容易检出的条件；

二、Gateway技术

    高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology），是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项zhuan利技术。它利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。

    这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列（Flanking Recombination Sequence），来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆"（Gateway Entry Clone），可以避免目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此称之为高通量基因克隆技术。

三、LIC技术

    Ligation-Independent cloning，简称LIC。采用LIC方法的pET载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。

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