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022-66387942在进行WB(Western Blot)实验时,选择合适的内参确实至关重要。内参的主要作用是像一把“尺子",用来衡量和校正每个样本的上样量,以及在上样过程中可能产生的实验误差。这样,我们就可以更加确信实验结果的准确性,因为它们已经经过了内参的校正。
一、选择内参需要遵循的原则?
1. 样本种属来源
匹配性原则:内参蛋白的选择应基于实验样本的物种来源。对于哺乳动物细胞和组织样本,常用的内参包括β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B等。这些蛋白在哺乳动物细胞中表达稳定,适合作为内参。
跨物种反应性:当研究涉及多个物种时,应选择具有广泛物种反应性的内参,或根据具体物种选择特异性内参。
2. 目的蛋白分子量
分子量差异:为了避免信号干扰和图像解析的复杂性,内参蛋白的分子量应与目的蛋白保持显著差异。一般建议内参蛋白与目的蛋白的分子量相差5kDa以上。
3. 目的蛋白表达部位
亚细胞定位:根据目的蛋白在细胞内的定位选择相应的亚细胞器内参。例如,核蛋白检测可选择Lamin A、Lamin B、Histone H3等核内参;膜蛋白检测可选择ATP1A1等膜内参;线粒体蛋白检测可选择VDAC1和COX IV等线粒体内参。
表达一致性:确保内参蛋白与目的蛋白在细胞内的表达部位一致,以提高实验结果的内部一致性。
4. 实验条件影响
稳定性评估:在选择内参时,需要充分了解实验条件对内参蛋白表达的影响。某些实验条件(如缺氧、糖尿病、药物处理等)可能会导致特定内参蛋白的表达水平发生变化。
适应性选择:选择那些在实验条件下表达稳定、受影响较小的内参蛋白。例如,在缺氧条件下,GAPDH的表达可能会增高,因此不适合作为内参;而在凋亡实验中,Lamin等也可能不适合作为内参。
5.文献参考和实验验证
文献查阅:查阅相关文献了解不同内参蛋白在不同实验条件下的表现,以获取有价值的参考信息。
二、选择内参的注意事项
选择内参的注意事项主要包括考虑目的蛋白分子量、种属特异性、蛋白表达位置、试验处理条件对内参表达的影响,以及确保内参蛋白的稳定性。
1. 目的蛋白分子量:
选择内参抗体时,应考虑目的蛋白分子量的大小,通常应保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KDa以上。例如,如果目的蛋白分子量为45KDa,则不宜选择分子量为42KDa的β-actin作为内参,而可以考虑选择分子量为36KDa的GAPDH作为内参。
种属特异性:不同种属的样本内参蛋白不同。例如,哺乳动物的组织或细胞样本通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH等,而植物来源的实验样本则可能选择Plant actin、Rubisco等。
2. 蛋白表达位置:
内参的选择还需考虑蛋白的表达部位。不同的表达部位可能需要不同的内参蛋白。例如,细胞骨架相关的研究不宜选择β-actin作为内参,因为β-actin是细胞的一种重要骨架蛋白,其表达量非常丰富,但在某些特殊情况下,如脂肪组织中,β-actin的表达量很少,此时β-actin就不再适用。
3. 试验处理条件:
试验处理条件对内参表达的影响也是一个重要的考虑因素。例如,GAPDH是糖酵解过程中的酶,关于糖代谢的研究(如糖尿病模型)中不宜选择GAPDH作为内参,因为某些细胞中缺氧也会影响GAPDH的表达。此外,肿瘤组织中的GAPDH相对于正常组织是高表达的,有文献报道GAPDH可以作为肿瘤标志物,因此在比较肿瘤组织与正常组织时,也不宜选择GAPDH作为内参。
4. 内参蛋白的稳定性:
内参蛋白的稳定性是选择内参的关键因素之一。内参蛋白应能在不同的实验条件下保持相对稳定的表达水平,以确保实验结果的准确性。内参蛋白的稳定性可以通过实验前的样品前处理来保证,但在某些特殊条件下,内参蛋白的表达也可能发生变化。
三、常用内参