qPCR的核心原理

让小编来详细解析一下qPCR（实时荧光定量PCR）的原理。这是一项在分子生物学、医学诊断、生物技术等领域的核心技术。

 一、qPCR的核心原理：实时监测与定量

简单来说，qPCR是一种在PCR（聚合酶链式反应）扩增过程中，通过荧光信号对DNA模板进行实时监测和定量的技术。

它解决了传统PCR只能进行终点检测（扩增结束后通过电泳看条带）而无法精确定量的问题。

二、两种主流的信号产生机制：

 1. 非特异性检测：DNA结合染料法（如SYBR Green）

- 原理：SYBR Green是一种能特异性地嵌入双链DNA（dsDNA）小沟中的荧光染料。当它与dsDNA结合后，荧光强度会显著增强。

- 过程：在每轮PCR的延伸阶段，新合成的双链DNA会结合染料，并发出荧光。荧光强度与反应体系中的双链DNA总量成正比。

- 优点：成本低，使用方便，无需设计探针，适用于任何PCR扩增。

- 缺点：特异性较低。染料会结合任何双链DNA，包括非特异性扩增产物和引物二聚体，从而产生假阳性信号。因此必须通过熔解曲线分析来验证扩增产物的特异性。

 2. 特异性检测：水解探针法（如TaqMan探针）

- 原理：该技术使用一个序列特异性的寡核苷酸探针。探针的5‘端带有一个报告荧光基团，3’端带有一个淬灭荧光基团。

- 过程：

    1.  当探针完整时，由于报告基团和淬灭基团距离很近，发生荧光共振能量转移，报告基团的荧光被淬灭。

    2.  PCR扩增时，当引物退火，探针也会特异性地结合到模板上。

    3.  Taq酶在延伸过程中，利用其5‘→3’外切核酸酶活性将探针水解，使报告基团与淬灭基团分离。

    4.  报告基团随即发出荧光。

- 优点：特异性ji高。只有靶序列被扩增时才会产生荧光信号，有效避免了非特异性扩增的干扰。

- 缺点：成本较高，需要为每个靶基因精心设计并合成探针。

 三、如何定量？—— Ct值的概念

qPCR定量的关键在于 Ct值。

- 定义：Ct值 是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

- 意义：模板DNA的起始拷贝数越多，达到荧光阈值所需的扩增循环数就越少，即Ct值越小。反之，起始拷贝数越少，Ct值越大。

- 定量基础：理论上，PCR每个循环产物量翻倍（指数增长期）。因此，两个样品之间的Ct值相差1，意味着起始模板量相差约2倍。

通过已知浓度的标准品绘制标准曲线，就可以根据未知样品的Ct值精确计算出其起始模板量。定量方法主要有绝对定量和相对定量。

  总结

qPCR技术凭借其高灵敏度、高特异性、精确定量和操作便捷的特点，已经成为现代生命科学研究和分子诊断的基石技术。从基础科研的基因功能探索，到临床的疾病诊断与监控，再到食品安全检测，其应用无处不在。理解其原理是正确进行实验设计和数据分析的关键。

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