为什么要用内参抗体？

更新时间：2025-12-02

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一、内参抗体简介

内参抗体，就是用来检测内参蛋白的抗体。它的唯1使命，是作为一个“标尺"或“参照物"，来校正你实验中的各种误差。

在Western Blot等实验中，你的最终目的是比较不同样本中目标蛋白的表达量差异。但很多操作环节都会引入变量，导致比较失真，例如：

细胞裂解程度不同 ➜ 上样蛋白总量不同。

上样操作误差 ➜ 每个孔实际加载的蛋白量不同。

转膜效率不均 ➜ 转移到膜上的蛋白量不同。

显色时间波动 ➜ 信号强度不稳定。

如何解决？引入一个在样本中恒定表达的蛋白质作为参照，这就是内参蛋白。而检测它的抗体，就是内参抗体。

二、内参抗体工作原理

1. 前提假设：内参蛋白（如GAPDH、β-Actin）在所有样本、所有处理组中的表达量是基本恒定的。

2. 同步检测：在检测你的目标蛋白（一抗孵育）之后或同时，用内参抗体去检测同一张膜上的内参蛋白。

3. 数据校正：

如果A样本的目标蛋白信号很强，但它的内参信号也很强，说明可能是A样本上样量偏多。

如果B样本的目标蛋白信号弱，但它的内参信号也弱，说明可能是B样本上样量偏少。

最终，你需要用【目标蛋白的信号强度】除以【内参蛋白的信号强度】，得到一个相对表达量。用这个校正后的值在不同样本间进行比较，才是准确可靠的。

三、常用内参抗体选择（取决于样本和研究系统）

内参蛋白	常用抗体克隆/类型	主要适用范围	注意事项
GAPDH	小鼠单抗（如6C5）	zui常用，适用于大多数细胞和组织样本。	在某些代谢研究中或特殊处理下，其表达可能发生变化。
β-Actin	小鼠单抗（如8H10D10）	细胞质蛋白，适用于细胞和组织，非常常用。	在肌肉细胞或某些癌细胞中表达可能不稳定，分子量（~42 kDa）与常见蛋白接近，需注意区分。
β-Tubulin	小鼠单抗（如9F3）	细胞骨架蛋白，作为细胞质内参。	与β-Actin类似。
Histone H3	兔多抗或单抗	细胞核蛋白内参。专门用于核蛋白提取物或研究核内事件。	不适用于全细胞裂解液。
Lamin B1	兔多抗或单抗	核膜蛋白内参，比H3更稳定，是优质的核内参。	不适用于全细胞裂解液。
Vinculin	小鼠单抗（如7F9）	细胞骨架蛋白，分子量较大（~124 kDa），可作为高分子量内参。	在某些细胞粘附和迁移研究中可能变化。
COX IV	兔多抗或单抗	线粒体内参。用于线粒体蛋白提取物。	仅用于细胞器级别研究。

四、关键注意事项

根据样本和研究目的选择：这是最重要的原则。研究核蛋白就用核内参，研究全细胞蛋白就用GAPDH或β-Actin。

分子量错开：内参蛋白的分子量应与你的目标蛋白有明显差异，方便在同一张膜上同时或先后检测。

验证表达稳定性：在进行正式实验前，先用内参抗体检测一下你的实验样本（特别是经过药物处理、基因敲除等操作后），确认所选内参的表达确实稳定不变。

同源物种反应性：确保你购买的内参抗体能识别你实验样本的物种（如人、小鼠、大鼠）。

一句话总结、

内参抗体是实验的“纠错官"，通过检测恒定表达的内参蛋白，来校正上样量和其他技术误差，确保你观察到的目标蛋白差异是真实的生物学变化，而非操作失误。没有它，Western Blot的定量比较就失去了根基。

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