MLPA检测原理

一、MLPA核心原理一句话概括

MLPA通过设计一对特殊的、靶向相邻DNA序列的探针，只有当这对探针同时与靶序列wanmei结合时，才能连接成一个完整的模板，随后被通用引物扩增并定量。扩增产物的量直接反映了靶序列的拷贝数。

二、 MLPA检测原理分步详解

下面，我们来详细解读流程中的每一个关键步骤：

 第1步：探针杂交

   一对探针：针对每一个待检测的靶位点，都设计有两条非常短的寡核苷酸探针。

       左探针：包含一段靶序列特异性杂交序列 + 一段通用的“引物结合"序列X。

       右探针：包含一段靶序列特异性杂交序列 + 一段长度不等的“填充序列" + 一段通用的“引物结合"序列Y。

   特异性结合：将这一对探针与变性后的样本DNA混合。它们会寻找并精确地杂交到目标DNA上相邻的位置（通常只间隔1个核苷酸）。

 第2步：连接反应（最关键的一步）

   “连接依赖"的核心：只有当左、右探针都wanmei地与靶DNA结合并紧密相邻时，连接酶才能将它们共价连接成一条完整的、长的DNA模板。

   严苛的质控：如果靶序列缺失（拷贝数为0）或发生点突变导致探针无法结合，连接反应就不会发生。这确保了后续信号的特异性，避免了假阳性。

 第3步：PCR扩增

   通用引物扩增：使用一对针对所有连接产物上通用序列X和Y的引物进行PCR扩增。

   产物长度各异：由于每个右探针的“填充序列"长度不同，因此每个靶位点对应的最终PCR产物都具有独特的长度（就像不同大小的“条形码"）。

 第4步：毛细管电泳分离与定量

   按长度分离：将所有PCR产物进行毛细管电泳，严格按照片段长度进行分离。

   荧光检测：PCR引物或探针上标记有荧光基团，因此每个长度的片段会产生一个荧光信号峰。

 第5步：数据分析

   峰高/面积 = 相对拷贝数：通过软件分析每个峰的高度或面积。将其与同一反应中多个内参基因（已知为二倍体，拷贝数稳定）的峰进行比较。

   结果解读：

       正常拷贝数（2份）：靶位点峰高与内参峰高比值约为1.0。

       缺失（1份或0份）：比值约为0.5或0。

       重复/扩增（3份或以上）：比值约为1.5或更高。

三、 MLPA原理的独特优势

1.  高通量：单次反应可轻松检测40-50个不同的靶位点。

2.  高特异性与准确性：依赖“双探针wanmei结合"的连接步骤，如同双重校验，极大减少了非特异性扩增。

3.  对DNA质量要求低：因为探针很短（~50-70 nt），即使DNA部分降解（如FFPE样本），也能有效杂交和连接，而长片段PCR则会失败。

4.  可检测甲基化（MS-MLPA）：通过对右探针的杂交序列进行HhaI酶切位点设计。如果靶序列被甲基化，酶切被阻止，探针可连接扩增；如果未甲基化，酶切断开探针，无法扩增。通过比较酶切处理与未处理的信号，即可判断甲基化状态。

四、与其他技术的核心区别

总结来说，MLPA的原理精髓在于其“连接依赖"和“长度编码"的设计，使其成为检测已知基因拷贝数变异和甲基化的一种高度多重、精准且经济高效的技术，特别适用于临床诊断和大规模筛查。

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