赛默飞Lipo3000 转染试剂的详细步骤和关键注意事项

核心特点： Lipo3000 是阳离子脂质体试剂，其配方中包含专属的 P3000™ 增强剂，能显著提高转染效率，尤其对难转染细胞和DNA转染效果出色。其操作是将脂质体与DNA分别稀释后再混合，简化了流程。

一、标准转染步骤（以24孔板为例）

以下步骤可按比例放大或缩小。

 材料准备

- Lipofectamine 3000 试剂

- P3000™ 增强剂（随试剂盒提供）

- 待转染的质粒DNA

- Opti-MEM® 或其它无血清培养基（必须使用，不能用wan全培养基或PBS）

- 状态良好、密度约70-90%的细胞（具体zui-佳密度需根据细胞类型优化）

- 无抗生素的wan全培养基（转染前后更换）

 实验前一日：细胞铺板

将细胞接种于24孔板中，使转染时细胞密度达到 70-90% 汇合度。使用正常的wan全培养基。

 转染当日（以每孔计算）

A. 溶液配制（使用前轻轻混匀各试剂，切勿涡旋）

1.  稀释质粒DNA溶液：

       取一支无菌离心管，加入 50 µL Opti-MEM 培养基。

       加入 0.5 - 1.0 µg 质粒DNA（zui-佳用量需优化）。

       加入 1 µL P3000™ 增强剂。轻轻吹打或轻弹管壁混匀，室温孵育5分钟（可选，但推荐）。

2.  稀释Lipofectamine 3000试剂：

       取另一支无菌离心管，加入 50 µL Opti-MEM 培养基。

       加入 1.5 µL Lipofectamine 3000 试剂。立即轻轻吹打或轻弹混匀（脂质体容易沉降）。室温静置 5分钟。

B. 形成脂质体-DNA复合物

   将 稀释好的DNA溶液（步骤A1） 全部加入 含有稀释脂质体的管子（步骤A2） 中。

   轻轻吹打混匀 或 轻弹管壁混匀。切勿涡旋。

   室温静置 10-15分钟，让复合物稳定形成。溶液可能会轻微浑浊，这是正常现象。

C. 将复合物加入细胞

   将 100 µL 的脂质体-DNA复合物溶液，逐滴均匀地加入到含细胞的孔中。

   轻轻前后左右摇晃培养板，使复合物分布均匀。

   将细胞放回37°C，5% CO₂培养箱中继续培养。

D. 换液与检测（时间点需优化）

   转染后4-6小时，观察细胞状态。如果脂质体毒性较大，此时应更换为新鲜的wan全培养基（可含抗生素）。

   如果细胞状态良好，也可不换液继续培养。

   在转染后 24-72小时（取决于实验目的和报告基因）进行蛋白或mRNA水平的检测。

二、关键注意事项与优化建议

1.  细胞状态至关重要：使用低传代、生长旺盛的细胞。转染时细胞必须处于对数生长期。

2.  无血清与无抗生素：配制复合物必须使用 Opti-MEM。转染前后培养基应不含抗生素，以减少细胞毒性和干扰。

3.  试剂轻柔混匀：Lipofectamine 3000 和形成的复合物都不能涡旋，剧烈操作会破坏脂质体结构。

4.  DNA纯度要求高：使用内毒素低、纯度高的质粒（OD260/280 ≈ 1.8-2.0）。

5.  比例优化：shou ci实验必须进行剂量优化。优化两个变量：

       DNA用量：通常在0.25 µg - 1.5 µg/孔（24孔板）之间测试。

       Lipofectamine 3000 用量：与DNA的比例（µL : µg）通常在 1:1 到 3:1 之间测试（例如，0.5 µg DNA 搭配 0.5 µL， 1.0 µL， 1.5 µL试剂）。

6.  P3000™增强剂：其用量与DNA量成正比（通常为 2 µL/µg DNA），但也可以微调。

7.  阴性对照：务必设置只加脂质体复合物（不含DNA）的对照组，以评估脂质体本身的细胞毒性。

8.  复合物孵育时间：10-15分钟足够，过长（如>30分钟）可能降低效率。

三、简明步骤总结

1.  铺板：细胞达70-90%汇合。

2.  配液A：Opti-MEM + DNA + P3000，混匀。

3.  配液B：Opti-MEM + Lipo3000，混匀，静置5分钟。

4.  混合：将A加入B，混匀，室温静置10-15分钟。

5.  加样：将复合物逐滴加入细胞，轻柔混匀。

6.  培养：4-6小时后换液（视情况），继续培养24-72小时检测。

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