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CELLSCRIPT™体外加帽试剂盒工作原理

 更新时间:2023-02-01    点击量:659

CELLSCRIPT™的使命是提供好的转录产品和技术,用于制造和使用RNA以便进行临床研究和治疗的细胞翻译。

 

目前的产品包括多种体外转录试剂盒、加帽类似物或加帽酶的5' RNA加帽试剂盒和3' RNA多聚腺苷酸化的试剂盒,以及用于转录、加帽、poly(A)尾mRNA以进行翻译的多合一试剂盒。

 

其中,ScriptCap™ Cap 1 Capping System(C-SCCS1710)包含ScriptCap加帽酶、ScriptCap 2'-O-甲基转移酶、GTP和SAM等成分,对体外转录的RNA进行转录后加帽修饰。Cap 0或Cap 1上限均可构建,效率接近100%(这不能通过共转录加帽方法来完成)。

 

ScriptCap加帽酶在体外催化具有5‘-三磷酸基的初级RNA的5’末端加成帽核苷酸。“帽核苷酸"或“帽"是一种鸟嘌呤核苷,它通过5‘C连接到一个三磷酸基团,然后再连接到初级mRNA转录本中最多的5’核苷酸的5‘碳上,在大多数真核生物中,帽核苷酸中鸟嘌呤7位的氮是甲基化的。表示为:m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')。其中m7G代表N7-甲基鸟嘌呤核苷,PPP代表帽子核苷的5’碳与初级RNA转录本的第一个核苷酸之间的三磷酸桥,N1(PN)x-OH(3’)代表初级RNA转录本,其中N1是最多的5’核苷酸。

 

ScriptCap加帽酶可依次催化三种不同的酶反应:

 

(1) RNA三磷酸酶将RNA的5‘三磷酸裂解成二磷酸:

 

pppN1(p)Nx-OH(3')——ppN1(pN)x-OH(3') + Pi

 

(2) RNA鸟苷酸转移酶将GTP连接到RNA最5‘核苷酸(N1)的5’二磷酸上:

 

ppN1(pN)x-OH(3') + GTP——G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + PPi

 

(3) 鸟嘌呤-7-甲基转移酶以S-腺苷甲硫氨酸(SAM或ADOMet)为辅因子,催化帽核苷酸中鸟嘌呤7-氮的甲基化:

 

G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoMet——m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoHyc

 

 

这一过程被称为“盖帽",与未盖帽的RNA相比,它提高了RNA的稳定性和翻译效率。ScriptCap盖帽酶构建的封端RNA产物具有“0"帽结构。在体外,通过同时使用ScriptCap 2‘-O-甲基转移酶和ScriptCap盖帽酶,可以将CAP0 RNA转化为“CAP1"结构。

 

ScriptCap 2‘-O-甲基转移酶通过将供体分子SAM上的甲基转移到CAP 0 RNA倒数第二个核苷酸的2’-O位,从CAP 0-RNA制备CAP1-RNA,合成具有CAP 1结构的RNA。

 

图片1.png

 

Cap1 RNA可以进一步提高mRNA的体内翻译效率,并有助于将mRNA标记为相对于细胞内免疫监视机制的“自身RNA"。

 

 

ScriptCap1盖帽系统提供了一种在IVT反应中通过共转录盖帽来制造盖帽RNA的替代方案,在IVT反应中,用二核苷酸盖帽类似物(例如m7GpppG)代替部分GTP,如果RNA的5‘末端不是结构化的,使用ScriptCap 1盖帽系统的盖帽效率可以接近100%。相反,由于CAP类似物与GTP竞争RNA聚合酶的转录启动,共转录的盖帽效率受到CAP类似物的浓度及其与GTP浓度之比的限制。因此,在转录反应中使用CAP类似物盖帽的RNA百分比总是小于100%。在使用CAP类似物的共转录盖帽反应中可以产生的CAP RNA的量也受到降低GTP浓度以允许CAP类似物竞争转录起始的需要的限制。另一方面,如果要盖帽的RNA具有高度结构的5‘末端,则与CAP类似物共转录盖帽可能是有益的。

 

优势:灵活进行cap0和cap1的加帽;效率JI高,接近100%;同类产品可直接交叉使用以及价格合适。

 

应用:进行体外mRNA的修饰,用作体外蛋白表达系统和生理试验;前体mRNA的研究试验以及疫苗研究。


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