免疫组化（IHC）核心技术要点

一个成功的IHC实验，以下七个环节至关重要，如同一个精密的链条，缺一不可。

免疫组化（IHC）核心技术要点一：样本制备 - 基石

组织固定：

要点： 及时、充分、适度。离体组织应尽快（通常30分钟内）放入足量（10-20倍体积）的10%中性福尔马林缓冲液中。

目的： 保存抗原性，防止降解和弥散。固定不足会导致抗原丢失；固定过度会遮蔽抗原表位，导致后续抗原修复困难。

石蜡包埋与切片：

要点： 组织脱水、透明、浸蜡过程要ce底但不过度。切片厚度通常为3-5μm，要求平整、无褶皱、无裂痕。

目的： 获得高质量的组织切片，为后续染色提供基础。

免疫组化（IHC）核心技术要点二：抗原修复 - 关键步骤

为什么需要： 福尔马林固定会使蛋白质交联，遮蔽抗原表位。抗原修复的目的是打破这些交联，使抗原重新暴露。

主要方法：

热诱导表位修复（HIER）： zui常用。使用柠檬酸盐（pH 6.0）或EDTA/EGTA（pH 8.0-9.0）缓冲液，在微波炉、高压锅或水浴锅中加热。pH值的选择对某些抗体至关重要。

酶消化修复： 使用胰蛋白酶、胃蛋白酶等。适用于部分固定过度或特定抗原。

要点： 根据目标抗原和一抗说明书，优化修复方法和pH值。修复后需自然冷却，避免骤冷。

免疫组化（IHC）核心技术要点三： 内源性过氧化物酶阻断

要点： 在加入一抗前，用3% H₂O₂溶液处理切片，孵育10-15分钟。

目的： 阻断组织内源性的过氧化物酶（尤其在红细胞、粒细胞中），防止在后续DAB显色时产生非特异性背景着色。

免疫组化（IHC）核心技术要点四：封闭

要点： 使用与二抗来源同种的正常血清（如，二抗是山羊抗兔，则用正常山羊血清）或BSA（牛血清白蛋白），室温封闭20-30分钟。

目的： 封闭组织切片上非特异性的蛋白质结合位点，减少一抗、二抗的非特异性吸附，降低背景。

免疫组化（IHC）核心技术要点五：抗体孵育- 核心反应

一抗孵育：

要点： 抗体浓度、孵育时间和温度是三大关键变量。必须参照说明书并进行预实验优化。孵育通常在4°C过夜（特异性好）或室温1-2小时（快速）。

目的： 特异性识别并结合目标抗原。

二抗孵育：

要点： 二抗需与一抗的种属和亚型匹配。通常室温孵育30-60分钟。

目的： 携带标记物（如酶HRP或荧光基团）与一抗结合，起放大信号的作用。

免疫组化（IHC）核心技术要点六：显色

要点： zui常用的是DAB（二氨基联苯胺） 显色。DAB在HRP催化下产生棕褐色不溶性沉淀。

关键： 镜下控制显色时间！ 通常在显微镜下观察，待特异性信号清晰而背景未着色时立即终止反应（一般几十秒到几分钟）。时间过短则信号弱，过长则背景深。

其他： AEC（红色）等，但产物溶于有机溶剂，需水性封片剂封片。

免疫组化（IHC）核心技术要点七：复染、脱水、封片

复染： 常用苏木精（Hematoxylin） 对细胞核进行蓝色复染，提供组织形态学对照。

脱水透明： 经酒精梯度脱水，二甲苯透明，使组织透亮。

封片： 使用中性树胶封片，长期保存。

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