Takara RR047A（PrimeScript™ RT Master Mix）反转录步骤及其原理

这款试剂盒是一款性能优异、操作非常简便的预混式反转录试剂，它将所有所需组分（除模板RNA和RNase Free水外）预先混合在一起，大大减少了操作步骤和污染风险。

Takara RR047A 操作步骤：

以下是标准的操作流程，非常简洁。在进行操作前，请务必在冰上进行，并使用RNase-Free的枪头和试管。

 实验前准备：

1.  RNA模板： 确保RNA质量好，无降解，无基因组DNA污染。建议使用前用DNase I处理RNA样本。

2.  试剂解冻： 将RR047A Master Mix置于冰上wanquan解冻，使用前轻轻涡旋混匀，避免产生气泡。

 第一步：配制反应体系

在一个无菌、无RNase的微量离心管中，按以下顺序和用量加入各组分：

总体积： 20 µL

计算示例： 如果你要加入 500 ng 的 RNA（浓度为 100 ng/µL，则需要 5 µL），那么计算如下：

   5× Master Mix： 4 µL

   RNA： 5 µL

   RNase Free dH₂O： 20 - 4 - 5 = 11 µL

注意： 轻轻用移液器吹打混匀，短暂离心收集液滴至管底。

 第二步：进行反转录反应

将配制好的反应管放入PCR仪或水浴锅中，按以下程序运行：

1.  37°C for 15 分钟 （反转录反应）

2.  85°C for 5 秒 （反转录酶失活反应）

3.  4°C 保持 （暂时保存）

程序解读：

   37°C， 15分钟： 这是反转录酶合成cDNA的最佳温度和时间。

   85°C， 5秒： 这是一个快速的热失活步骤，用于灭活反转录酶，防止其在后续的qPCR反应中干扰Taq酶的活性。这是RR047A的一个重要优点，无需复杂的纯化步骤即可直接用于qPCR。

 第三步：产物保存与使用

   反应结束后，将得到的cDNA溶液置于冰上，可立即用于后续的PCR或qPCR实验。

   若需长期保存，请置于 -20°C 冰箱。避免反复冻融，建议分装保存。

 注意事项：

1.  RNA质量： 这是实验成功的首要条件。确保RNA的完整性（通过琼脂糖凝胶电泳检查），并且A260/A280比值在1.8-2.0之间，表明纯度良好。

2.  无基因组DNA污染： 如果后续进行qPCR并需要高精度定量，强烈建议在反转录前用gDNA Eraser（Takara的另一款产品）处理RNA样本，以ce di去除基因组DNA。

3.  无RNase操作： 全程使用RNase-free的枪头、离心管和试剂，佩戴手套，防止RNase污染导致RNA降解。

4.  精确加样： 确保所有组分的加样量准确，尤其是Master Mix和RNA模板。

5.  阴性对照： 建议设置一个无酶对照（No-RT Control），即用等量的水代替Master Mix。这个对照在后续qPCR中用于检测是否有基因组DNA的残留扩增。

 总结

Takara RR047A（PrimeScript RT Master Mix） 的核心优势在于其预混形式和快速热失活特性。它将复杂的多组分混合步骤简化为“一步加样"，并通过短短5秒的85°C加热即可灭活酶活，使得从RNA到cDNA再到qPCR的整个过程可以无缝、高效、高通量地进行，极大地提高了实验的重复性和便捷性，特别适用于基因表达分析（qRT-PCR）研究。

Takara代理——天津益元利康生物科技有限公司

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