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细胞凋亡的检测方法

 更新时间:2024-07-10    点击量:166
  细胞凋亡的过程在不同点受到严格调控,因此可以评估所涉及的不同蛋白质的活性。由于细胞凋亡和坏死的过程可能重叠,因此必须通过两种不同的测定来确认细胞死亡的机制。下面让我们一起来看看细胞凋亡的检测方法吧!
 
  1. 细胞形态学变化
 
  用光学显微镜观察苏木精和伊红染色的组织切片可以观察到凋亡细胞。该方法检测的是处于凋亡后期的细胞,但不能识别处于凋亡早期的细胞。透射电子显微镜(TEM)是确认细胞凋亡的金标准。
 
  2. DNA片段化
 
  DNA laddering 技术是另一种检测细胞凋亡的方法,它使细胞凋亡过程中核酸内切酶切割的产物可视化。这涉及通过琼脂糖凝胶电泳从裂解的细胞匀浆分离中提取 DNA。所得 DNA 条带形成 DNA 阶梯,可用于检测凋亡细胞数量高的组织中的细胞凋亡。然而,DNA 片段化仅发生在细胞凋亡的后期阶段,因此无法检测早期阶段的细胞。另一种方法是 TUNEL(Terminal dUTP Nick End-Labeling)方法,它也通过酶法标记 DNA 链的末端来检测核酸内切酶切割产物。末端转移酶用于将 dUTP 连接到 DNA 片段的 3' 端。然后用各种探针标记 dUTP,以便通过光学显微镜、荧光显微镜或流式细胞术进行检测。虽然这种技术很快并且可以在几个小时内完成,但它可能会因坏死细胞而产生假阳性结果。
 
  3. caspases、裂解底物、调节剂和抑制剂的检测
 
  可以使用各种类型的半胱天冬酶活性测定来检测超过 13 种已知的参与细胞凋亡的半胱天冬酶。一些免疫测定可以检测裂解的底物,如 PARP 和已知的细胞修饰,如磷酸化组蛋白。包括蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫组织化学在内的多种测定可用于检测半胱天冬酶活化。Apoptosis PCR microarray是一种较新的方法,它使用real-time PCR来指示大约112个参与细胞凋亡的基因的表达。微阵列旨在生成编码必需受体、配体、细胞内调节剂和参与程序性细胞死亡调节的转录因子的基因的表达谱。
 
  4. 线粒体检测
 
  证明细胞色素c释放的线粒体测定 允许检测内在途径早期阶段的变化。激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM) 创建活细胞的薄光学切片,然后用于监测一段时间内完整单细胞中的各种线粒体事件。该技术可测量线粒体通透性、线粒体内膜去极化、线粒体氧化还原状态、Ca2+通量和活性氧等参数。
 
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