MLPA 是什么？

一、MLPA 是什么？

MLPA 是一种用于检测特定核酸序列拷贝数变异的高通量、半定量技术。它可以同时检测多达50个不同的靶序列，包括基因缺失、重复、甲基化状态以及点突变。

核心特点：

1. 高通量： 一次反应可检测40-60个不同靶位点。

2. 高效经济： 仅需少量DNA（20-100 ng），就能获得相当于数十次传统PCR或qPCR实验才能得到的信息。

3. 灵敏度高： 可以检测出杂合性缺失和单拷贝的变异。

4. 应用广泛： 可用于DNA和RNA分析。

二、 MLPA 技术原理（分步详解）

MLPA 技术的巧妙之处在于将 探针连接 与 PCR 扩增相结合。整个过程可以分为四个主要步骤：

第一步：DNA 变性

将样本DNA（通常是100-200 ng）加热至98°C，使其双链解链为单链。

第二步：探针杂交

降温至60°C左右，使MLPA特异性探针与目标DNA序列进行杂交。

MLPA探针的结构（最关键的部分）：

每一对MLPA探针都包括两个半探针：

左半探针： 包含一个通用引物序列和一个靶标特异性序列。

右半探针： 包含另一个通用引物序列、一个靶标特异性序列和一个填充序列。

这两个半探针的靶标特异性序列是相邻的，只有当它们同时与目标DNAwammei互补结合时，才能进行下一步。

第三步：连接反应

加入 连接酶。只有两个半探针都wanquan杂交到靶序列上，它们才会首尾相连，被连接酶共价连接成一条完整的核酸链。

关键点： 如果靶序列发生缺失或点突变，导致探针无法wanquan结合，连接反应就不会发生。这是MLPA技术特异性的基础。

第四步：PCR 扩增

使用一对通用荧光标记引物对所有成功连接的探针进行PCR扩增。

因为所有探针都含有相同的通用引物序列，所以可以用同一对引物扩增所有不同的靶标。

为什么能定量？

每个连接成功的探针，其扩增产物的长度是不同的（由右半探针中的“填充序列"长度决定）。

通过毛细管电泳分离这些不同长度的产物，并通过检测荧光强度来定量。

基本原理： 在一个样本中，某个靶序列的拷贝数越高，对应的完整探针就越多，PCR扩增后该长度片段的荧光信号就越强。

三、 MLPA 工作流程概要

样本DNA制备。

MLPA反应： 将DNA与MLPA探针混合物、缓冲液等混合，进行过夜杂交和连接反应。

PCR扩增： 使用通用引物进行扩增。

片段分析： 使用毛细管电泳仪进行分析。

数据分析： 专用软件将样本的信号峰值与正常对照样本进行比较，通过计算比值来判定拷贝数。

比值 ≈ 1.0： 正常拷贝数（二倍体）。

比值 ≈ 0.5： 杂合性缺失（单拷贝）。

比值 ≈ 0： 纯合性缺失（无拷贝）。

比值 ≈ 1.5： 重复（三拷贝）。

四、 MLPA 的主要应用领域

MLPA技术因其高效和灵活，被广泛应用于：

1. 遗传病诊断：

杜氏/贝氏肌营养不良症： 检测DMD基因大片段缺失/重复。

2. 脊髓性肌weisuo症： 检测SMN1基因外显子7的纯合缺失。

遗传性肿瘤综合征： 检测BRCA1/2等基因的缺失/重复。

染色体微缺失/微重复综合征： 如22q11.2缺失综合征（迪乔治综合征）、威廉姆斯综合征等。

3. 肿瘤学：

检测癌基因的扩增（如HER2在乳腺癌中的扩增）。

检测抑癌基因的缺失。

4. 表观遗传学分析（MS-MLPA）：

这是一种特殊形式的MLPA，探针设计包含了对甲基化敏感的限制性内切酶的识别位点。

通过酶切处理，可以区分甲基化和非甲基化的DNA，从而用于检测基因的甲基化状态，如印记基因疾病（Prader-Willi/Angelman综合征）和肿瘤中的基因启动子甲基化。

5. 基因分型与点突变检测：

通过设计特殊的探针，可以检测已知的单核苷酸多态性或点突变。

五、 MLPA 的优缺点

总结来说，MLPA是一种非常精巧、实用且高效的靶向拷贝数分析技术，在临床分子诊断和研究中扮演着重要的角色。

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