CCK-8实验全攻略：原理、步骤与注意事项

　　在细胞生物学、药物开发、肿瘤研究等领域，快速、准确地评估细胞增殖与毒性是至关重要的实验环节。其中，CCK-8试剂盒因其操作简便、灵敏度高、安全性好等优势，已成为国内外实验室的标配检测方法。
 

　　一、CCK-8实验原理：高效的酶促反应显色
 

　　CCK-8，全称为Cell Counting Kit-8，其核心原理是一种基于显色反应的生物化学检测方法。
 

　　在活细胞内部，始终存在一种名为线粒体脱氢酶的代谢酶。该酶具有持续的活性。CCK-8试剂中含有一种名为WST-8 的独特水溶性四唑盐化合物。
 

　　当活细胞与CCK-8试剂共同孵育时，会发生以下连锁反应：
 

　　1. WST-8分子进入细胞。
 

　　2. 在活细胞线粒体内的脱氢酶催化下，WST-8被还原，生成高度水溶性的橙色甲瓒产物。
 

　　3. 该甲瓒染料会溶解在细胞培养液中，且其生成量与活细胞的数量成正比。
 

　　因此，通过使用酶标仪在450nm波长下测量培养液的吸光度值，即可直接、准确地反推出样品中活细胞的相对数量。细胞增殖越快或毒性越小，吸光度值就越高。
 

二、CCK-8实验详细步骤（以96孔板为例）
 

　　实验前准备：
 

　　仪器： 酶标仪、CO₂培养箱、超净工作台、移液器。
 

　　材料： 96孔细胞培养板、CCK-8试剂。
 

　　细胞： 处于对数生长期的健康细胞。
 

　　DAY 1
 

　　1. 对前一天培养好的细胞消化、离心、计数。
 

　　2. 在96孔板上接种100μL 3k-7k/孔的细胞，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养24小时。
 

　　DAY 2
 

　　1. 在显微镜下观察细胞生长状态和密度，取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔进行实验。
 

　　2. 配制不同浓度梯度的样本溶液，如300、100、33.3、11.1、3.7、1.2、0.4、0.14uM。每个浓度三个复孔加入到96孔板中，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养适当时间长度。如6，12，24或48小时。
 

　　DAY 3/4
 

　　1. CCK8使用前在室温下解冻并离心。
 

　　2. 用倒置显微镜检测细胞生长状态，并用4X/10X取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔拍照记录。
 

　　3. 在每孔中加入10μL的CCK-8溶液。
 

　　4. 在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养0.5-4小时。
 

　　5. 用酶标仪在450 nm处测量吸光度。
 

　　6. 用Excel及Graphpad Prism处理并分析结果。
 

　　7. 结果示例图：
 

　　三、关键注意事项与技巧
 

　　l 避免气泡： 孔内气泡会严重干扰读数，加样和检测前可短暂离心孔板以去除气泡。
 

　　l 设置复孔： 建议每个实验条件设置至少3个复孔，以确保数据的统计学意义。
 

　　l 孵育时间优化： 孵育时间过长会导致颜色过深，超出检测线性范围；过短则信号太弱。必须通过预实验摸索最佳时间。
 

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